新冠病毒核酸检测

更新时间:2022-08-18

核酸检测是查找患者的呼吸道标本、血液或粪便中是否存在外来入侵的病毒的核酸,来确定是否被新冠病毒感染。因此一旦检测为核酸“阳性”,即可证明患者体内有病毒存在。核酸检测阳性可以作为新型冠状病毒感染确诊的金标准。新冠病毒感染人体之后,首先会在呼吸道系统中进行繁殖,因此可以通过检测痰液、鼻咽拭子中的病毒核酸判断人体是否感染病毒。

基本信息

中文名新冠病毒核酸检测
作用判断人体是否感染病毒

检测原理

所有生物除朊病毒外都含有核酸,核酸包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA),新型冠状病毒是一种仅含有RNA的病毒,病毒中特异性RNA序列是区分该病毒与其它病原体的标志物。新型冠状病毒出现后,我国科学家在极短的时间里完成了对新型冠状病毒全基因组序列的解析,并通过与其它物种的基因组序列对比,发现了新型冠状病毒中的特异核酸序列。临床实验室检测过程中,如果能在患者样本中检测到新型冠状病毒的特异核酸序列,应提示该患者可能被新型冠状病毒感染。

检测新型冠状病毒特异序列的方法最常见的是荧光定量PCR(聚合酶链式反应)。因PCR反应模板仅为DNA,因此在进行PCR反应前,应将新型冠状病毒核酸(RNA)逆转录为DNA。在PCR反应体系中,包含一对特异性引物以及一个Taqman探针,该探针为一段特异性寡核苷酸序列,两端分别标记了报告荧光基团和淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;如反应体系存在靶序列,PCR反应时探针与模板结合,DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针酶切降解,报告基团与淬灭基团分离,发出荧光。每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子产生。荧光定量PCR仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)与病毒核酸浓度有关,病毒核酸浓度越高, Ct值越小。不同生产企业的产品会依据自身产品的性能确定本产品的阳性判断值。

检测流程

对于新型冠状病毒的核酸检测,首先根据试剂盒说明书样本要求部分进行样本采集,常规的样本类型包括咽拭子、鼻拭子、痰液、支气管灌洗液、肺泡灌洗液等。

获得患者样本后,需尽快进行检测,如无法立即检测需要转运的样本,应按照说明书的要求进行低温封装,并送到专门的检测机构进行检测。检测机构收到样本后,对样本进行核酸提取,核酸提取试剂应使用批准产品说明书中指定的核酸提取试剂盒。

病毒RNA需要首先逆转录为cDNA,再进行扩增检测。PCR扩增和检测应使用批准产品说明书中指定的荧光定量PCR仪,通过荧光定量PCR所得到的样本Ct值的大小,可以判断患者样本中是否含有新型冠状病毒。

上述过程中样本的采集、保存、转运,样本核酸的提取和检测、结果的判读均须严格按照试剂盒说明书要求进行。

标本采集

采集标本种类

每个病例必须采集急性期呼吸道标本(包括上呼吸道标本或下呼吸道标本),重症病例优先采集下呼吸道标本;根据临床需要可留取便标本、全血标本、血清标本和尿标本。

标本种类:

1.上呼吸道标本:包括鼻咽拭子、咽拭子等。

2.下呼吸道标本:深咳痰液、肺泡灌洗液、支气管灌洗液、呼吸道吸取物等。

3.便标本/肛拭子:留取粪便标本约10克(花生大小),如果不便于留取便标本,可采集肛拭子。

4.血液标本:尽量釆集发病后7天内的急性期抗凝血,采集量5ml,建议使用含有EDTA抗凝剂的真空釆血管采集血液。

5.血清标本:尽量釆集急性期、恢复期双份血清。第一份血清应尽早(最好在发病后7天内)釆集,第二份血清应在发病后第3~4周釆集。采集量5ml,建议使用无抗凝剂的真空釆血管。血清标本主要用于抗体的测定,不进行核酸检测。

6.尿标本:留取中段晨尿,采集量2~3ml。

标本采集和处理

1.鼻咽拭子:采样人员一手轻扶被采集人员的头部,一手执拭子,拭子贴鼻孔进入,沿下鼻道的底部向后缓缓深入,由于鼻道呈弧形,不可用力过猛,以免发生外伤出血。待拭子顶端到达鼻咽腔后壁时,轻轻旋转一周(如遇反射性咳嗽,应停留片刻),然后缓缓取出拭子。

2.咽拭子:被采集人员先用生理盐水漱口,采样人员将拭子放入无菌生理盐水中湿润(禁止将拭子放入病毒保存液中,避 3 免抗生素引起过敏),被采集人员头部微仰,嘴张大,并发“啊”音,露出两侧咽扁桃体,将拭子越过舌根,在被采集者两侧咽扁桃体稍微用力来回擦拭至少3次,然后再在咽后壁上下擦拭至少3次,将拭子头浸入含2~3ml病毒保存液(也可使用等渗盐溶液、组织培养液或磷酸盐缓冲液)的管中,尾部弃去,旋紧管盖。咽拭子也可与鼻咽拭子放置于同一管中。

3.鼻咽抽取物或呼吸道抽取物:用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液或从气管抽取呼吸道分泌物。将收集器头部插入鼻腔或气管,接通负压,旋转收集器头部并缓慢退出,收集抽取的粘液,并用3ml采样液冲洗收集器1次(亦可用小儿导尿管接在50ml注射器上来替代收集器)。

4.深咳痰液:要求病人深咳后,将咳出的痰液收集于含3ml 采样液的采样管中。如果痰液未收集于采样液中,可在检测前,加入2~3ml采样液,或加入痰液等体积的痰液消化液。使用时将储存液用去离子水稀释至50 ml,与痰液等体积混合使用,或者参照试剂说明进行使用,也可采用痰液等体积的 含1g/L蛋白酶K的磷酸盐缓冲液将痰液化。

5.支气管灌洗液:将收集器头部从鼻孔或气管插口处插入气管(约30cm深处),注入5ml生理盐水,接通负压,旋转收集器头部并缓慢退出,收集抽取的粘液,并用采样液冲洗收集器1次,也可用小儿导尿管接在50ml注射器上来替代收集。

6.肺泡灌洗液:局部麻醉后将纤维支气管镜通过口或鼻经过咽部插入右肺中叶或左肺舌段的支气管,将其顶端契入支气管分支开口,经气管活检孔缓缓加入灭菌生理盐水,每次30~50 ml,总量100~250ml,不应超过300ml。

7.粪便标本:取1ml标本处理液,挑取黄豆粒大小的便标本加至管中,轻轻吹吸3-5次,室温静置10分钟,以8000rpm离心5分钟,吸取上清液进行检测。也可使用HANK’S液或其它等渗盐溶液、组织培养液或磷酸盐缓冲液溶解便标本制备便悬液。如患者出现腹泻症状,则留取粪便标本3~5ml,轻轻吹打混匀后,以8000 rpm离心5分钟,吸取上清液备用。

8.肛拭子:用消毒棉拭子轻轻插入肛门3~5cm,再轻轻旋转拔出,立即放入含有3~5ml病毒保存液的15ml外螺旋盖采样管中,弃去尾部,旋紧管盖。

9.血液标本:建议使用含有EDTA抗凝剂的真空釆血管采集血液标本5ml,根据所选用核酸提取试剂的类型确定以全血或血浆进行核酸提取。如需分离血浆,将全血1500~2000rpm离心10 分钟,收集上清于无菌螺口塑料管中。

10.血清标本:用真空负压采血管采集血液标本5ml,室温静置30分钟,1500~2000rpm离心10分钟,收集血清于无菌螺口塑料管中。

其他材料:依据设计需求规范采集。

实验室检测

实时荧光RT-PCR方法

结果判断

阴性:无Ct值或Ct为40。

阳性:Ct值\u003c37,可报告为阳性。

灰区:Ct值在37-40之间,建议重复实验,若重做结果Ct值 \u003c40,扩增曲线有明显起峰,该样本判断为阳性,否则为阴性。

注:如使用商品化试剂盒,则以厂家提供的说明书为准。

病例确认

实验室确认阳性病例需满足以下两个条件中的一个:

1.同一份标本中新型冠状病毒2个靶标(ORF1ab、N)实时荧光RT-PCR检测结果均为阳性。如果出现单个靶标阳性的检测结果,则需要重新采样,重新检测。如果仍然为单靶标阳性,判定为阳性。

2.两种标本实时荧光RT-PCR同时出现单靶标阳性,或同种类型标本两次采样检测中均出现单个靶标阳性的检测结果,可判定为阳性。核酸检测结果阴性不能排除新型冠状病毒感染,需要排除可能产生假阴性的因素,包括:样本质量差,比如口咽等部位 的呼吸道样本;样本收集的过早或过晚;没有正确的保存、运输和处理样本;技术本身存在的原因,如病毒变异、PCR抑制等。

血清抗体检测

血清抗体检测(胶体金、磁微粒化学发光、ELISA)用作新型冠状病毒核酸检测阴性病例的补充检测,在疑似病例诊断中与核酸检测协同使用,或用于人群血清学调查和既往暴露调查。

实验室确认阳性病例需满足以下两个条件中的一个:

1.血清新型冠状病毒IgM和IgG抗体阳性;

2.血清新型冠状病毒IgG抗体由阴性转为阳性或恢复期较急 性期有4倍及以上升高。发病后7天内的急性期抗凝血用于IgM和IgG检测,如果检测结果阴性,建议发病后10天内再次采集进行检测。发病后3-4周恢复期血清用于IgG检测。

注:如果采用商品化试剂盒,则以厂家说明书为准。

假阴性

核酸检测的“假阴性”是指从患者的临床症状、肺部影像学结果甚至流行病学史都支持为新冠肺炎,但患者病毒核酸检测结果为“阴性”,检测结果与临床不符。

核酸检测的“假阳性”是指患者本来没感染新冠病毒,但核酸检测出现阳性结果。此“假阳性”的出现通常是由于实验室检测过程中标本间的交叉污染或实验室核酸污染造成的。在技术层面上讲,只要实验室严格落实质控工作,可有效避免“假阳性”的产生。

通常“假阴性”产生原因为:

1.病毒入侵人体初期,人体内病毒量尚未达到可检测的程度。在病毒潜伏期、轻度症状、严重症状的不同时期,人体的不同部位(如鼻咽部、口咽部、气管、支气管和肺泡)的病毒载量会存在差异。所以,采样时机和采样部位的不同,可能导致所采集的标本中没有足够量的病毒;

2.任何检测试剂都有其检测下限(即敏感性),如果患者标本内的病毒达不到所使用试剂的检测下限,则会出现假阴性;

3.实验室仪器设备性能和人员检测能力差、质量管理落实不到位等也会产生“假阴性”;

4.采样不规范、采集部位不当、采集标本不典型,导致标本中被病毒感染的细胞太少或没有。即可能造成“假阴性”。

行政案件

2021年6月8日至7月13日,梁河警方联合梁河边境检查站、河西边境检查站连续查获43起变造或使用变造核酸检测证明的行政案件,抓获违法嫌疑人61人,涉案人员全部行政拘留

全球进展

2021年8月,德国政府宣布将从10月起停止向全体民众提供免费新冠病毒检测,以期进一步推动新冠疫苗接种。

2021年9月,阿联酋阿布扎比酋长国宣布,鉴于国内新冠病毒感染率已经降到了0.2%,从19日开始取消对入境者进行核酸检测的要求。

2021年10月20日,中国科学家研发出快速筛查技术,只需在小袋子里呼气30秒,就可以在5—10分钟内得到新冠检测结果。

2021年10月26日,国务院应对新型冠状病毒肺炎疫情联防联控机制发布《关于进一步强化当前新冠病毒核酸检测服务的通知》,要求核酸检测机构要向社会提供24小时核酸检测服务,特别是对“愿检尽检”人群的核酸检测要力争在6小时之内报告结果,并通过信息化手段及时向群众推送,鼓励根据检测量配备新冠病毒核酸快检试剂及配套设备,减少等待时间。

2022年5月13日,国家卫健委医政医管局监察专员郭燕红国务院联防联控机制新闻发布会上表示,在大城市建立步行15分钟核酸“采样圈”,有利于老百姓就近就便进行核酸检测,有利于感染的早发现,进一步提高疫情监测预警的灵敏性。

检测价格

2021年9月,国家医保局指导各地医疗保障部门降低公立医院核酸检测价格,进一步降低了疫情防控和社会运行成本。截至9月16日,已有广东、湖北、上海、天津、河北等共计30个省份下调公立医院新冠病毒核酸检测价格,绝大多数省份将单人单检价格降至每人份60元或更低水平,10人混检价格降至每人份15元或更低水平。如福建省单人单检从每人份80元降至53元,降幅33.8%;10人混检从15元降至12元,降幅20%。

2021年12月,山东省发展改革委、省财政厅发布的最新通知指出:山东省县级以上疾病预防控制机构新冠病毒核酸检测价格将进一步降低,单人单检收费标准下调为35元/人次。

北京市医保局会同市卫生健康委、市财政局以及市人力社保局印发《关于进一步降低新型冠状病毒核酸检测项目价格的通知》,自2021年12月11日起北京市公立医疗机构新冠病毒核酸检测单样本价格由58元降低至35元/次,5样本、10样本混合检测价格同步由每样本18元、13元统一降低至8元。此次是北京市对新型冠状病毒核酸检测项目的第6次动态调整。

2021年12月,国家医保局启动第三轮全国联调,指导各地进一步降低公立医院新冠病毒核酸检测的价格和费用。

2022年4月,国家医疗保障局办公室、国务院应对新型冠状病毒肺炎疫情联防联控机制医疗救治组发布通知,各省份要将单人单检降至不高于每人份28元;多人混检统一降至每人份不高于8元。实行检测价格和试剂价格分开计价收费的省份,要按照不高于上述水平设置封顶标准。

2022年5月25日,国家医保局办公室、国务院应对新型冠状病毒肺炎疫情联防联控机制医疗救治组印发《关于进一步降低新冠病毒核酸检测和抗原检测价格的通知》,要求各地将新冠病毒核酸检测单人单检降至不高于每人份16元,多人混检降至不高于每人份5元。

检测技术

2022年1月,国务院联防联控机制医疗救治组发布《新冠病毒核酸20合1混采检测技术规范》。20合1混采检测技术(将采集自20人的20支拭子集合于1个采集管中进行核酸检测的方法)可大幅度提高检测效率,更加适用于大规模人群核酸筛查工作。与已有10合1混采检测技术相比,主要是在采样管方面做出调整。

2022年4月19日,国际标准化组织(ISO)发布《体外诊断检验系统—核酸扩增法检测严重急性呼吸系统综合征冠状病毒 2(SARS-CoV-2)的要求及建议》(ISO/TS 5798:2022)国际标准。

最新政策

2022年7月29日,国家卫生健康委员会官方网站发布关于进一步推动新冠病毒核酸检测结果全国互认的通知。全文如下:

新冠病毒肺炎疫情发生以来,各地区各有关部门认真贯彻党中央、国务院有关决策部署,积极推进核酸检测结果互通互认,为保障人民群众安全有序出行和复工达产发挥了重要作用。当前,部分地方仍然存在对其他地区核酸检测结果不认可、要求重复检测等问题。为进一步推动核酸检测结果全国互认,切实便利群众出行,现将有关事项通知如下:

一、高度重视核酸检测结果全国互认的重要性。各地区各有关部门要充分认识进一步科学精准做好疫情防控工作的重要性和紧迫性,坚持以人民为中心的发展思想,站在疫情防控“全国一盘棋”的高度,将核酸检测结果全国互认作为高效统筹疫情防控和经济社会发展、切实维护正常生产生活秩序的“关键小事”抓紧抓实,切实便利人员安全有序出行。

二、不同渠道展示的核酸检测结果具有同等效力。群众通过国务院客户端、国家政务服务平台、各省份健康码、核酸检测机构网站或APP查询到的核酸检测结果及群众持有的纸质核酸检测结果,凡在当地防控政策有效时间内的(以出具报告时间为准),具有同等效力,各地在查验时都应当予以认可,严禁以本地健康码未能查询、未在本地开展核酸检测等为由拒绝通行,拒绝群众进入公共场所、乘坐公共交通工具,不得要求群众重复进行核酸检测。

三、强化宣传引导和督促落实。各地区要立即行动,将核酸检测结果全国互认的要求落实到基层一线,确保基层管理人员认真执行。各地区要通过公告、新闻报道等多种形式多种途径,加强对核酸检测结果全国互认的宣传解读,让群众知晓,接受群众监督。国务院联防联控机制综合组将会同相关部门加大督促指导力度,对本通知发布后仍不互认、造成不良影响的地方要予以通报。对个人违规使用假冒、篡改等核酸检测结果的,要依法依规处理。


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